Phenomenex | Hướng dẫn sử dụng cột HPLC/UHPLC Luna

Thông tin chung

Mỗi cột Luna sản xuất bởi Phenomenex được chuẩn bị và kiểm tra riêng biệt, có kèm theo Chứng nhận đảm bảo chất lượng (COA) về điều kiện thử nghiệm, thông số vận hành và thông tin cột. Thông tin cột, gồm các kết quả thử nghiệm và kết quả kiểm thử hiệu năng, cần được nhập vào hệ thống quản lý để tiện theo dõi và tra cứu.

Kiểm tra

Khi nhận được cột, kiểm tra các thông số kích thước cột, kích thước hạt, thiết bị để đảm bảo chính xác cột đã đặt hàng. Kiểm tra cột có bị hư hỏng do quá trình vận chuyển hay không? Tiến hành kiểm tra cột ngay để đảm bảm hiệu năng cột và ghi lại kết quả kiểm tra lên hệ thống quản lý thông tin cột.

Tính chất cột

Pha tĩnh	Mô tả	Kích thước hạt (µm)	Kích thước lỗ (Å)	Diện tích bề mặt (m2/g)	Tải trọng carbon (%)	pH hoạt động	Pha đảo	Pha thuận	HILIC	IEX
C18	Phối tử C18 được tối ưu hóa để cải thiện hình dạng đỉnh	1,6	100	260	11	1,5 – 8,5*	x
Polar C18	Tăng tính chọn lọc/ khả năng lưu giữ với các chất phân tích phân cực mà không làm giảm khả năng lưu giữ của các chất không phân cực	1,6; 5	100	260	9	1,5 – 8,5*	x
PS C18	Dạng phối hợp giúp gia tăng khả năng lưu giữ các acid phân cực đồng thời cải thiện hình dạng đỉnh của các base mạnh	1,6; 5	100	260	9	1,5 – 8,5*	x		x

*pH hoạt động với điều kiện gradient. pH hoạt động 1,5 – 10 với điều kiện đẳng dòng.

Pha tĩnh	Mô tả	Kích thước hạt (µm)	Kích thước lỗ (Å)	Diện tích bề mặt (m2/g)	Tải trọng carbon (%)	pH hoạt động	Pha đảo	Pha thuận	HILIC	IEX
Silica (2)	Không liên kết với silica	3, 5, 10, 10-PREP, 15	100	400	–	2,0 – 7,5		x	x
C5	Phối tử 5 carbon	5, 10	100	440	12,5	1,5 – 9,0*	x
C8 (2)	Phối tử C8 được tối ưu hóa để cải thiện hình dạng đỉnh	3, 5, 10, 10-PREP, 15	100	400	13,5	1,5 – 9,0*	x
C18 (2)	Phối tử C18 được tối ưu hóa để cải thiện hình dạng đỉnh	2,5, 3, 5, 10, 10-PREP, 15	100	400	17,5	1,5 – 9,0*	x
CN	Pha CN linh hoạt	3, 5, 10	100	400	7,0	1,5 – 7,0	x	x
NH2	NH2 bền và có thể phục hồi	3, 5, 10	100	400	9,5	1,5 – 11	x	x	x	x
Phenyl-Hexyl	Phenyl được gắn kết với phối tử C6 (hexyl)	3, 5, 10, 10-PREP, 15	100	400	17,5	1,5 – 9,0*	x
SCX	Acid benzene sulfonic	5, 10	100	400	Khả năng liên kết: 0,15 meq/g	2,0 – 7,0				x
HILIC	Diol có thể phục hồi, liên kết chéo	3, 5	200	200	5,7	1,5 – 8,0			x
PFP (2)	Pentafluorophenyl liên kết với C3 (propyl)	3, 5	100	400	11,5	1,5 – 8,0	x		x

*pH hoạt động 1,5 – 9 với điều kiện gradient. pH hoạt động 1,5 – 10 với điều kiện đẳng dòng.

Dung môi vận chuyển cột

Trừ khi có các ghi chú khác được ghi trên cột, cột Luna CN và NH₂ được vận chuyển trong Acetonitrile/Hexan (1:99 tt/tt). Cột Luna SCX được vận chuyển trong 150 mM ammonium phosphate, pH 6,0. Cột Luna HILIC được vận chuyển trong điều kiện HILIC: Acetonitrile/100 mM ammonium formate, pH 3,2 (90:10 tt/tt). Các cột khác được vận chuyển trong Acetonitrile/H₂O (65:35 tt/tt).

Tốc độ dòng, áp suất, nhiệt độ

Đây là những thông số cơ bản của cột Luna HPLC và UHPLC. Các thông số không có giá trị tuyệt đối và có thể thay đổi phụ thuộc vào hệ thống sắc ký lỏng, điều kiện sắc ký và mẫu phân tích. Các giá trị bên dưới

Kích thước hạt (µm)	Đường kính trong (mm)	Tốc độ dòng (mL/phút)	Áp suất (psi)
			50 mm	150 mm	250 mm
1,6	2,1	0,5	4500	11000	–
2,5	2,0	0,4	2000	–	–
2,5	3,0	0,8	2300	–	–
3	2,0	0,2	750	1500	2400
3	3,0	0,6	950	1500	2400
3	4,6	1,25	812	1500	2300
5	2,0	0,2	450	650	1000
5	3,0	0,5	450	900	1400
5	4,6	1,0	750	850	1200
10	4,6	5,0	450	350	500
10	21,2	15,0	203	350	500

Tốc độ dòng (không phụ thuộc vào kích thước hạt):

i) Đường kính trong 4,6 mm: 1,0 mL/phút

ii) Đường kính trong 2,1 mm: 0,2-0,6 mL/phút

Áp suất tối đa:

iii) Kích thước hạt 1,6 µm: >15.000 psi (1.034 bar) có thể ảnh hưởng tuổi thọ cột.

iv) Kích thước hạt 3 µm hay 5 µm: >5000 psi (345 bar) có thể ảnh hưởng tuổi thọ cột.

Nhiệt độ tối đa:

v) Nhiệt độ tối đa phụ thuộc vào điều kiện sắc ký, không nên quá 60 °C cho các cột sắc ký Luna.

vi) Sử dụng cột liên tục ở nhiệt độ cao có thể ảnh hưởng tuổi thọ cột.

vii) Nhiệt độ tối đa của cột sắc ký Luna Omega phụ thuộc vào pha động:

1. Acid formic: 90°C (C18, Polar C18), 80°C (PS C18)
2. Acid trifluoroacetic: 80°C (C18, Polar C18), 60 °C (PS C18)
3. Đệm phosphate pH 7,5: 50°C (C18, PS C18), 30°C (Polar C18)
4. Đệm ammonium bicarbonate pH 8,5: 50°C (C18, PS C18), 30°C (Polar C18)

Tính tương thích pha động

Khi sử dụng cột HPLC/UHPLC, cần đảm bảo dung môi, nguyên liệu sử dụng phù hợp với điều kiện HPLC và tránh sự tách pha giữa dung môi và dung dịch đệm.

Pha động nên được lọc trước khi sử dụng. Các cột Luna Polar C18, PS C18, PFP (2) và SCX ổn định trong môi trường 100% H₂O. Các cột Luna đều ổn định trong môi trường 100% dung môi hữu cơ. Tuy nhiên cần đảm bảo pH pha động không vượt quá giới hạn pH pha tĩnh (phần Đặc trưng cột sắc ký).

Thiết lập cột sắc ký

Thiết lập ban đầu của hệ thống sắc ký lỏng là rất quan trong để đảm bảo được hiệu năng cột:

– Đảm bảo rằng hệ thống sắc ký lỏng đã sẵn sàng:

1. Các seal, đường dẫn, kim tiêm sạch
2. Đường dẫn thông suốt (không đứt gãy hoặc có bọt khí)
3. Đường nền ổn định
4. Áp suất cố định

Rửa bơm và đường dẫn với pha động (các dung môi chuẩn HPLC và có thể hỗn hòa với nhau).

Kiểm tra các điều kiện pha động:

1. Đảm bảo các thành phần pha động đã được trộn, lọc và khử khí trước khi sử dụng.
2. Đảm bảo các dung môi vận chuyển cột, dung môi còn lại trong hệ thống sắc ký và pha động có thể hỗn hòa với nhau.

Thiết lập tốc độ dòng 0,1 mL/phút (với cột có đường kính trong 2,1-4,6 mm) và lắp đặt cột (hướng mũi tên theo hướng di chuyển của dòng dung môi). Tăng tốc độ dòng lên 0,2 mL/phút (đường kính trong 2,1 mm) hay 1,0 mL (đường kính trong 4,6 mm) trong 5-10 phút.

Ngưng dòng và làm sạch outlet trước khi kết nối với đầu dò.

Lắp đầu nối vào trong outlet, chạy cột với tối thiểu 10 lần thể tích cột ở tốc độ dòng (~0,2 mL/phút) và duy trì kiểm soát điều kiện áp suất.

1. Tốc độ dòng liên tục khi áp suất ổn định. Khi xuất hiện bọt khí, áp suất sẽ thay đổi.
2. Sự chênh lệch áp suất lớn có thể khiến cột bị hư hỏng.

Khi áp suất và tín hiệu đầu dò ổn định, cột đã sẵn sàng để sử dụng.

Kiểm tra hiệu năng cột

Sử dụng điều kiện bên dưới để tiến hành kiểm tra hiệu năng cột

Pha đảo
Tên:	Hỗn hợp thử Pha đảo 2
Số hiệu:	AL0-3045
Mẫu thử	Uracil, Acetophenone, Toluene, Naphthalene
Dung môi:	Acetonitrile/H2O (65:35 tt/tt)
Đầu dò:	UV 254 nm
Thể tích tiêm:	Phụ thuộc vào kích thước

 

Pha thuận
Tên:	Hỗn hợp thử Pha thuận
Số hiệu:	AL0-3033
Mẫu thử	meta-Xylene, Nitrobenzene
Dung môi:	Hexan/Acetonitrile (99:1 tt/tt)
Đầu dò:	UV 254 nm
Thể tích tiêm:	Phụ thuộc vào kích thước

Rửa cột

Pha đảo:

– Rửa cột theo gradient đến điều kiện dung môi của hệ thống. Ví dụ: Lần tiêm mẫu cuối cùng với Đệm/Acetonitrile (75:25), bắt đầu rửa cột với 95:5 H₂O/Acetonitrile và tăng dần tỉ lệ dung môi hữu cơ (như 75:25 H₂O/Acetonitrile → 50:50 H₂O/Acetonitrile → 5:95 H₂O/Acetonitrile).

– Với các nguyên liệu kỵ nước hoặc có tính nhớt, rửa cột với Methylene chloride hoặc IPA. Khi sửa dụng IPA, rửa cột với tốc độ dòng thấp để tránh sự gia tăng áp suất, dẫn đến độ nhớt của dung môi tăng.

– Với các nguyên liệu kỵ nước, rửa cột với THF.

Pha thuận:

– Rửa cột bằng Chloroform, IPA và/hoặc Methylene chloride với thể tích 10 lần dung tích cột.

– Tiếp theo, rửa cột bằng pha động.

Lưu ý:

– Khi rửa, cài đặt tốc độ dòng thấp hơn tốc độ dòng khi đo mẫu, đặc biệt rửa với Methanol, IPA.

– Nên rửa cột trong thời gian dài hơn rửa cột nhiều lần.

– Không nên sử dụng lượng lớn THF trong HPLC với hệ thống có ống nhựa. Với ống là kim loại, được rửa cột với THF.

– Đảo chiều cột và rửa với tốc độ dòng chậm.

Phục hồi cột

Pha đảo

– Áp dụng chương trình gradient như phần Rửa cột, thực hiện qua đêm với tốc độ dòng thấp.

Pha thuận

– Để loại bỏ H₂O, rửa cột với:

1. 30 mL 2,5% 2,2-Dimethoxypropan và 2,5% Acid acetic băng/Hexane.
2. Sau đó tiến hành như phần Rửa cột, thực hiện qua đêm với tốc độ dòng thấp.

Bảo quản cột

Đảm bảo cột đã sạch trước khi bảo quản. Các tác nhân cần loại bỏ trước khi tiến hành bảo quản: đệm, muối, mẫu phân tích, tác nhân ion hóa.

Điều kiện bảo quản được khuyến nghị:

– Pha đảo: Acetonitrile/H₂O (65:35 tt/tt), có thể thay thế Acetonitrile bằng Methanol.

– Pha thuận: 100% Hexane hoặc IPA.

– Trao đổi ion: 100% Methanol.

– HILIC: Acetonitrile/H₂O (80:20 tt/tt)

Lưu ý giúp gia tăng tuổi thọ cột

– Sử dụng các kỹ thuật chuẩn bị mẫu như chiết pha rắn (Cột SPE Strata^®-X) hoặc dụng cụ hỗ trợ (Bộ lọc ống tiêm Phenex^TM) để giảm thiểu việc đưa các chất không mong muốn vào trong cột, hệ thống.

– Sử dụng cột bảo vệ thích hợp để loại bỏ các hạt cơ học, tránh hư hỏng cột.

– Không để cột bị quá tải. Tiêm mẫu với thể tích, nồng độ thích hợp. Xem bảng: Khả năng tải cột

– Sử dụng chế độ phân tách phù hợp với từng cột. Xem bảng Tính chất cột để lựa chọn chế độ phù hợp với mỗi pha tĩnh.

– Bảo quản cột trong dung môi phù hợp.

– Khi thay đổi dung môi cần tiến hành một cách chậm rãi với tốc độ dòng thấp: 0,1 mL/phút (đường kính trong 2,1 mm) và 0,5 mL/phút (đường kính trong 4,6 mm).

Khả năng tải cột

Loại cột	Đường kính trong (mm)	Thể tích chế (mL)	Tốc độ dòng (mL)	Khối lượng tiêm (tối đa) (mg)	Thể tích tiêm (tối đa) (mg)
Cột mao quản (Phủ silica)	0,32	0,0075	0,001 – 0,02	0,001 (0,01)	1 (10)
Cột microbore	1,0	0,07	0,02 – 0,1	0,01 (0,1)	5 (25)
Cột phân tích	4,6	1,5	0,5 – 2,0	0,1 (2,5)	10 (200)
Cột bán điều chế	10,0	7,3	5,0 – 20	1,0 (25)	50 (1000)
Cột điều chế	20,0	29,2	10 – 200	5,0 (500)	200 (5000)

Bảo hành cột

Cột HPLC Phenomenex đảm bảo về tính nguyên vẹn, hiệu năng, chất lượng sản phẩm. Nếu có bất kì thắc mắc nào, xin liên hệ Đại diện kỹ thuật Phenomex. Chúng tôi sẽ cố gắng giải quyết vấn đề để mang lại sự hài lòng cho khách hàng. Trong trường hợp hoàn trả cột, cần cung cấp Mã xác nhận thu hồi của Phenomenex.

Từ chối trách nhiệm

Các cột mới nên được kiểm tra, so sánh với cột đã sử dụng bằng hỗn hợp kiểm tra khuyến nghị từ nhà sản xuất hoặc hỗn hợp kiểm tra phù hợp trong phân tích. Khi thay đổi dung môi, cần cân bằng lại hệ thống. Tuyệt đối không dùng các dung môi không hỗn hòa với nhau và không thay đổi dung dịch đệm/muối khi dung dịch đệm/muối không tan trong dung môi, những điều này sẽ gây hư hỏng cột. Đừng loại bỏ các thiết bị ở đầu cột, nếu không sẽ mất hiệu lực bảo hành.

Tổn thương cột

Xử lý cột một cách cẩn thận. Không đánh rơi hay gây các tác động vật lý mạnh lên cột. Không bắt đầu bơm với tốc độ dòng cao, nên tăng dần trong vài phút. Đặt giới hạn áp suất bơm để tránh tắc nghẽn. Việc tắt nghẽn có thể gây ảnh hưởng đến hiệu năng cột.

Cần thêm thông tin vui lòng liên hệ: