Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những kỹ thuật phân tách phổ biến nhất được sử dụng trong ngành dược cũng như các ngành công nghiệp hóa học khác; để định tính và định lượng các thành phần trong một hỗn hợp. Hỗn hợp được mang qua pha tĩnh của cột sắc ký bởi một dung môi, được gọi là pha động, dưới áp suất cao.
Khi nói đến việc lựa chọn pha động dùng cho HPLC, dung môi được lựa chọn dựa trên các loại tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh. Mặc dù có nhiều phương pháp HPLC khác nhau, bài viết này tập trung chủ yếu vào hai phương pháp: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo. Các pha động được cấu tạo từ hai thành phần chính: thành phần yếu thúc đẩy quá trình lưu giữ chất phân tích trên pha tĩnh và thành phần mạnh thúc đẩy quá trình rửa giải chất phân tích khỏi cột.
1. Pha động trong sắc ký pha thuận
Thành phần yếu của pha động trong sắc ký pha thuận phải là một dung môi không phân cực, vì khả năng phân tách trong phương pháp HPLC pha thuận phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh phân cực. Dung môi không phân cực sẽ không tương tác với chất phân tích, làm tăng khả năng lưu giữ chất phân tích trên pha tĩnh. Khi cần rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột, sử dụng một dung môi phân cực như một thành phần mạnh của pha động để tiến hành.
Các dung môi phổ biến nhất được sử dụng trong pha động sắc ký pha thuận như:
- Hexane
- Heptane
- Chloroform
- Benzene
- Ethyl Acetate
- Dichloromethane
- Ethanol
- Isopropanol
2. Pha động trong sắc ký pha đảo
Sắc ký pha đảo là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong HPLC. Khi nói về pha động của dụng trong phương pháp này, thành phần yếu phải là dung môi phân cực, giúp đẩy sự tương tác của các chất phân tích về phía pha tĩnh không phân cực. Từ đó, tăng thời gian lưu của chất phân tích.
Dung môi pha động phổ biến nhất trong sắc ký lỏng pha đảo là nước. Nước được pha trộn với một dung môi hữu cơ với tỉ lệ dao động từ 0% đến 100%. Các dung môi hữu cơ có thể sử dụng như acetonitrile, methanol hay một dung môi hữu cơ phân cực khác. Tăng tỉ lệ dung môi hữu cơ, hay còn gọi là thành phần mạnh, giúp rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột.
Pha trộn các dung môi trong pha động
Hiếm có trường hợp sử dụng dung môi đơn lẻ làm pha động trong HPLC, do đó cần lưu ý các trường hợp sau khi pha trộn dung môi:
- Khả năng hỗn hòa – Các dung môi được trộn với nhau phải có khả năng hỗn hòa, nghĩa là chất này có khả năng hòa tan với chất kia. VIệc sử dụng các dung môi không hỗn hòa có thể gây tổn thương vĩnh viễn đến cột.
- Nhiệt độ – Các dung môi phải có cùng nhiệt độ trước khi trộn. Để yên chúng một thời gian để đảm bảo điều kiện này.
- Độ tinh khiết – Các dung môi phải đạt chuẩn dùng cho HPLC hoặc cao hơn để đảm bảo khi phân tích sẽ có đường nền thấp và giảm thiểu các tổn thương lâu dài đến thiết bị. Điều này bao gồm dung môi nước được sử dụng, cần phải được đưa qua thẩm thấu ngược.
- Bước sóng hấp thụ UV – là bước sóng thấp nhất mà dung môi có thể được phát hiện. Các dung môi phải được lựa chọn sao cho chúng có bước sóng hấp thụ UV thấp hơn chất phân tích.
- Chỉ số khúc xạ – Các dung môi khi trộn phải có chỉ số khúc xạ khác biệt đáng kể so với mẫu.
- Độ nhớt – Các dung môi phải có độ nhớt thấp để đảm bảo chúng có thể dễ dàng đi qua pha tĩnh một cách hiệu quả. Dung môi có độ nhớt cao hơn sẽ tạo ra áp suất ngược trong thiết bị, có thể gây tổn thương cột và các bộ phận khác của thiết bị.
- Độ nén – Độ nén của dung môi có thể ảnh hưởng đến tốc độ dòng của pha động. Tốc độ dòng được duy trì ổn định bởi hệ thống bơm, nhưng tốc độ dòng của dung môi sử dụng phải được đồng nhất với nhau nếu có thể.
